Bereits in der ersten Jahresschrift des damals städtischen Museums wird eine Reihe von Ölporträts der Salzburger Erzbischöfe ebenso erwähnt wie die Bildnisse des Kurfürsten Ferdinand von Toskana, des Bayernkönigs Maximilian I. und des österreichischen Kaisers Franz I., die damals die jüngste Vergangenheit Salzburgs dokumentierten. Das Sammeln von Gemälden stellte immer eine zentrale Rolle in der Erwerbungspolitik des Salzburg Museum dar. 2001 wurde die gesamte Gemäldesammlung in zwei Bereiche gegliedert, die mit dem Jahr 1800 eine Zäsur findet, so dass in der Sammlung Gemälde bis 1800 das Mittelalter ebenso vertreten ist wie die Neuzeit und das Barock bis zum ausgehenden 18. Jahrhundert.

Ein Schwerpunkt liegt aufgrund der historischen Sammeltradition auf spätgotischer Tafelmalerei aus dem religiösen Umfeld, die meist als Geschenke und Legate in der zweiten Hälfte des 19. Jahrhunderts ins Museum gelangten. Zum Teil handelt es sich um Einzelobjekte als Reste von gotischen Altären, die aufgelöst wurden bzw. zu einem geringen Teil um vollständige Flügelaltäre oder Kombinationen des 19. Jahrhunderts. Ein zweiter Schwerpunkt liegt auf dem Porträt, vornehmlich des geistlichen Standes (Erzbischöfe) und des Salzburger Bürgertums – mehr als 500 Porträts der Zeit von 1490 bis 1800 zählen zum Bestand. Topografische Ansichten von Salzburg und religiöse, allegorische sowie mythologische Themen runden die Sammlung ab.

Die Zugänge in dieser Sammlung sind spärlich und richten sich nach dem Angebot auf dem Kunstmarkt und den Budgetmöglichkeiten – Schenkungen sind in diesem Bereich selten. Eine konkrete Ankaufspolitik ist aufgrund der Mittel nicht möglich. Eine der bedeutendsten Neuerwerbungen der letzten Jahre ist eine Ansicht der Stadt Salzburg aus dem Jahr 1599, die die älteste gemalte Ansicht Salzburgs darstellt und mit Mittel des Salzburger Museumsvereins erworben werden konnte.

Die Gemäldesammlung bildet einen zentralen Punkt in der Ausstellungspolitik, es gibt kaum eine Ausstellung, in der die Gemälde nicht präsent sind. Ebenso sind sie begehrte Leihobjekte anderer musealer Institutionen. Gerade die Sammlung der Bildnisse bildet über den Porträtwert einen interessanten kulturhistorischen Überblick über dreihundert Jahre Salzburger Geschichte.